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原發(fā)登革熱IgG間接法檢測(cè)試劑

簡(jiǎn)要描述:

原發(fā)登革熱IgG間接法檢測(cè)試劑
通過ELISA對(duì)四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進(jìn)行檢測(cè),是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法。 配對(duì)血清中IgG, 水平不斷升高是活動(dòng)性登革熱感染的表現(xiàn)。傳統(tǒng)上,血凝抑制試驗(yàn)(HAI)滴度被用于劃分原發(fā)性或繼發(fā)性感染。當(dāng)前的界定方法是采用及時(shí)分離至少7天的配對(duì)血清標(biāo)本檢測(cè),急性標(biāo)本的HAI滴度≥ 1:2560被認(rèn)為患者感染了繼發(fā)性黃病毒1。

更新時(shí)間:2025-01-03

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原發(fā)登革熱IgG間接法檢測(cè)試劑

 

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 

產(chǎn)品目錄號(hào)01PE30

預(yù)期用途

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性檢測(cè)登革熱病原血清型(12、34)血清中的IgG抗體輔助臨床實(shí)驗(yàn)室診斷出現(xiàn)臨床癥狀或既往感染登革熱病毒的患者。

 

概述

蟲媒病毒中的登革熱通過蚊子傳播,主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊。 登革熱病毒感染,與傷寒病有關(guān),其特征是突然發(fā)熱、劇烈頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹。 登革熱感染的嚴(yán)重并發(fā)癥包括登革出血熱和登革休克綜合征。此類并發(fā)癥的發(fā)病率增加與繼發(fā)性感染不同登革熱血清型有關(guān)。

 

通過ELISA對(duì)四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進(jìn)行檢測(cè),是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法。 配對(duì)血清中IgG, 水平不斷升高是活動(dòng)性登革熱感染的表現(xiàn)。傳統(tǒng)上,血凝抑制試驗(yàn)(HAI)滴度被用于劃分原發(fā)性或繼發(fā)性感染。當(dāng)前的界定方法是采用及時(shí)分離至少7天的配對(duì)血清標(biāo)本檢測(cè),急性標(biāo)本的HAI滴度≥ 1:2560被認(rèn)為患者感染了繼發(fā)性黃病毒1。

 

檢測(cè)原理

血清中存在的登革熱病毒抗體,與微孔測(cè)試條上聚苯乙烯表面附著的登革熱抗原結(jié)合物相結(jié)合。 洗去剩余的血清并添加過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。清洗微孔,再添加無(wú)色的底物系統(tǒng) - 四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫(TMB顯色液)。底物被酶水解后,顯色液變藍(lán)。用酸終止反應(yīng)后,TMB變黃。顯色表示測(cè)試樣本中存在登革熱IgG抗體。

 

提供的材料

  • 登革熱抗原(血清型1、2、3和4)包被微孔板-(12x8孔)。即用型。未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲(chǔ)存于干燥環(huán)境中。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • 清洗緩沖液(20倍) - 1瓶,60mL 20倍濃縮磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.2 – 7.6),含吐溫 20和防腐劑(0.1% Proclin™)。低溫可能結(jié)晶。若去除結(jié)晶,可在37孵育液體至澄清。混合均勻。用19體積的蒸餾水稀釋1體積的清洗緩沖液。稀釋后的緩沖液可在2-25儲(chǔ)存一周。
  • 樣本稀釋劑 – 2瓶, 50 mL(粉色)。即用型。Tris緩沖生理鹽水(pH 7.2 – 7.6),含防腐劑(0.1% Proclin™)和添加劑。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • HRP標(biāo)記抗人IgG – 1瓶,15mL(綠色)。即用型。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗人IgG,含防腐劑(0.1% Proclin™)和蛋白穩(wěn)定劑。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • TMB顯色液(TMB) - 1瓶,15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的混合物,存放于枸櫞酸鹽緩沖液中(pH 3.5 – 3.8)。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • 陽(yáng)性質(zhì)控品 – 1瓶,紅色瓶蓋,200μL人血清(含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素)。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  •  校準(zhǔn)品 – 1瓶,黃色瓶蓋,850μL人血清(含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素)。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • 陰性質(zhì)控品 – 1瓶,綠色瓶蓋,200μL人血清(含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素)。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-8可保持穩(wěn)定。
  • 終止液 – 1瓶,紅色瓶蓋,15mL。即用型。1M磷酸。有效期內(nèi)儲(chǔ)存于2-25可保持穩(wěn)定。

Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注冊(cè)商標(biāo)。

需要但未提供的材料

  • 精確、可調(diào)節(jié)的微量移液器,含一次性吸液頭(5-1000 μL容積)
  • 去離子水
  • 標(biāo)板清洗系統(tǒng)
  • 酶標(biāo)儀,含450nm濾波器
  • 計(jì)時(shí)器
  • 刻度量筒
  • 燒瓶
  • 試管或微滴定板,用于稀釋血清

注意事項(xiàng)

用于體外診斷

  • 在制備質(zhì)控品的過程中使用的所有人源性材料已經(jīng)過人類免疫缺陷病毒1/2(HIV 1 /2)抗體、丙肝(HCV)和乙肝表面抗原的檢測(cè),結(jié)果為陰性。但是,任何測(cè)試方法都不能*確信,且所有人源性質(zhì)控品和抗原包被微孔板都應(yīng)按照潛在傳染性材料處理。疾病控制和預(yù)防中心以及美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院建議將潛在傳染原按照生物安全二級(jí)2處理。
  • 該測(cè)試只能使用血清執(zhí)行。尚未建立使用全血、血漿或其它標(biāo)本基質(zhì)的方法。
  • 不可使用黃疸或脂血癥血清,以及出現(xiàn)溶血或微生物生長(zhǎng)的血清。
  • 不可加熱,否則血清將失去活性。
  • 在開始檢測(cè)前所有試劑必須平衡至室溫(20-25)。檢測(cè)受溫度變化的影響。微孔板在達(dá)到室溫(20-25)之前不可從密封袋中取出。
  • 直接用干凈的吸液頭從試劑瓶中吸出試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能導(dǎo)致污染。
  • 未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲(chǔ)存于干燥環(huán)境中。否則將產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。
  • 底物系統(tǒng):
    • 由于TMB易受金屬離子的污染,所以底物系統(tǒng)不能與金屬表面接觸。
    • 避免長(zhǎng)時(shí)間陽(yáng)光直射。
    • 有些清潔劑可干擾TMB的性能。
  • TMB可能呈現(xiàn)淡藍(lán)色,這不影響底物的活性或測(cè)定結(jié)果。累積。
  • 疊氮話鈉還抑制酶標(biāo)物的活性。在添加酶標(biāo)物時(shí)必須使用干凈的吸液頭,避免攜帶其它試劑的疊氮話鈉。

 

標(biāo)本采集和制備

靜脈穿刺獲取的血液應(yīng)該置于室溫(20-25)下直到凝塊形成,再按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院(CLSI)的《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——診斷用血液標(biāo)本的靜脈穿刺采集程序,H3》離心。應(yīng)該盡快分離血清。如果在2天內(nèi)不進(jìn)行檢測(cè),血清應(yīng)該2-8冷藏或者低于或等于- 20冷凍儲(chǔ)存。不*使用自解凍冷凍機(jī)儲(chǔ)存血清。不*使用黃疸血清,以及出現(xiàn)溶血、脂血或微生物生長(zhǎng)的血清。CLSI提供了儲(chǔ)存血液標(biāo)本的建議,《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——血液標(biāo)本的處理加工程序,H18》。

 

檢測(cè)程序

注: 確保所有試劑在開始測(cè)定前平衡至室溫(20-25)。在所給時(shí)間和溫度范圍以外進(jìn)行測(cè)試可能產(chǎn)生無(wú)效的結(jié)果。不在預(yù)定時(shí)間和溫度范圍內(nèi)的測(cè)試必須進(jìn)行重復(fù)。

 

ELISA程序

  • 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測(cè)試條槽。陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和校準(zhǔn)品各需5個(gè)微孔,一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi)。
  • 使用適當(dāng)?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅?yáng)性質(zhì)控品(P)、陰性質(zhì)控品(N)、校準(zhǔn)品(CAL)和患者樣本。
    • 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑?;旌暇鶆颉?/span> 

或者,

  • 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清,加入180μL樣本稀釋劑?;旌暇鶆?。
  • 吸取100 µL樣本稀釋劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品添加至對(duì)應(yīng)的微孔中。
  • 蓋住測(cè)定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
  • 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次(參考清洗程序)。
  • 吸取100 µL HRP標(biāo)記抗人IgG添加到每個(gè)微孔中。
  • 蓋住測(cè)定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
  • 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次(參考清洗程序)。
  • 吸取100 µL TMB添加到每個(gè)孔中。
  • 在室溫(20-25)下孵育10分鐘,從次添加開始計(jì)時(shí)。藍(lán)色將會(huì)顯現(xiàn)。
  • 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個(gè)孔中,計(jì)時(shí)同TMB添加步驟?;旌暇鶆颉K{(lán)色將變成黃色。
  • 在30分鐘內(nèi)讀取每個(gè)孔在450nm波長(zhǎng)的吸光度,參考濾波器為600-650nm。

注: 如果使用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì),將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>

 

清洗程序

為了清除未復(fù)合的樣本或成分,有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟。

A.自動(dòng)洗板機(jī)

  • *抽凈所有微孔。
  • 在清洗循環(huán)期間將每個(gè)孔裝滿至邊緣(350μL)。
  • 完成6次清洗后,將測(cè)定板倒立于吸水紙巾上用力敲打,確保清除所有清洗緩沖液。
  • 為了確保有效清洗,必須維持自動(dòng)洗板機(jī)良好的保養(yǎng)。必須始終遵守廠商的清潔說(shuō)明。

B.手動(dòng)清洗

  • 將測(cè)定板的內(nèi)含物丟棄到適當(dāng)?shù)膹U物容器。
  • 用適當(dāng)?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡,否則會(huì)降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
  • 再將微孔填滿清洗緩沖液,并立即丟棄。
  • 重復(fù)步驟(3)4次,共用清洗緩沖液清洗六(6)次。
  • 后一次清洗完成后,丟棄微孔的內(nèi)含物并將測(cè)定板置于吸水紙巾上敲打,以確保清除所有清洗緩沖液。

原發(fā)登革熱IgG間接法檢測(cè)試劑

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